近期，华中科技大学同济医学院附属同济医院祝伟教授团队联合探因医学方圆博士团队在《Pathogens》期刊发表研究型文章。本研究从宏基因组数据中重建了医院不动杆菌ST410菌株基因组，并描述了其系统发育和流行病学特征，强调了宏基因组监测在评估细菌致病风险、以及破译毒力基因或其他类型基因遗传多样性方面的应用前景。
· 研 / 究 / 背 / 景
医院不动杆菌(Acinetobacter nosocomialis) 是醋酸钙-鲍曼不动杆菌(ACB)复合群的重要组成部分，是常见的条件致病菌，具有在医院环境中持续感染的能力。宏基因组二代测序(mNGS)技术的快速发展让识别和量化临床标本中的任何微生物成为可能。已有研究表明，基于mNGS数据建立“病原风险检测限”可进一步评估条件致病菌的致病风险。
近年来，医院不动杆菌感染率不断上升，引起了医学界和科学界的重视。尽管现有的细菌表面成分研究已揭示了在医院不动杆菌病理生理学中起重要作用的几种毒力因子，但仍需要对毒力基因谱系进行系统性研究，以阐明医院不动杆菌致病力的多因素性。
基于此背景，本研究从宏基因组样本中重建了完整的医院不动杆菌ST410菌株基因组，并结合已公开的基因组数据，深入分析了其群体遗传学和分子流行病学特征。
· 研 / 究 / 内 / 容
· 主 / 要 / 结 / 果
| 医院不动杆菌的致病风险
本研究的mNGS结果中，7,213,985条reads(约占总数的51.2%)被分配至医院不动杆菌。分类图谱显示，该群落中相对丰度在0.1%以上的微生物有42种。在这些类群中，11种为不动杆菌，其中医院不动杆菌的丰度为66.5%，其余物种的丰度范围为4.4%(鲍曼不动杆菌)至0.1%(溶血不动杆菌)。有趣的是，化脓性链球菌是在医院环境中通过常规培养检测到的单一物种，但根据mNGS结果，这些革兰氏阳性链球菌的丰度仅为0.024% (2778个reads)。
研究者从公共数据库中获取了来自健康人不同部位的医院不动杆菌丰度信息(表1)。分析发现，皮肤、口腔和粪便微生物群中有时会检出医院不动杆菌，但其在正常菌群中的丰度很低。相反，本研究检出的医院不动杆菌丰度过高，表明其是与该病例感染相关的高危病原体。
表1：来自健康人5个部位的样本中医院不动杆菌检出率和丰度概述
| 三种组装策略的比较
通过比较重叠群(contig)和N50发现，组装III(基于参考基因组的reads招募，然后从头组装)的基因组组装质量最好。该方案产生了123个大于500bp的重叠群，总重叠群大小约3.89Mb，N50为82,591bp，基因组完整性和污染率分别为100%和0%。其次为组装II(宏基因组组装和分箱)，该方案产生了103个大于500bp的重叠群，总重叠群大小约3.87Mb，N50为79,429bp。组装I(基于K-mer的read分类和组装)产生的基因组质量相对较差，N50为40,596bp。基于上述评估结果，将组装III产生的基因组用于后续系统发育和泛基因组分析。
表2：从宏基因组中重建的医院不动杆菌菌株基因组组装的比较
| 组装三的基因组系统发育研究
为推断宏基因组菌株(命名为WHM01)的组织起源，研究者进行了全基因组核苷酸序列同源性分析(ANI)。如图1所示，WHM01与医院不动杆菌M2和SSA3基因组的ANI分别为97.64%和97.63%，但与其他不动杆菌基因组的ANI值相对较低(86.23%-91.92%)，这再次证实了WHM01属于医院不动杆菌。此外，通过PasteurMLST确定了WHM01的序列类型为ST410(20-26-26-14-26-16-23)。
图1：从宏基因组中重建的医院不动杆菌WHM01基因组的物种鉴定
为探索WHM01与在公共数据库中获取的156个医院不动杆菌分离株之间的关系，研究者构建了基于核心基因组SNP的系统发育树，并整合了细菌序列型(ST)(图2)。所有菌株可分为33个ST型，其中13株被归入新的ST型。包含菌株最多的ST型分别为ST768(19株)、ST68(18株)、ST433(13株)、ST279(12株)和ST410(10株)。WHM01与2018年在马来西亚分离的ST410菌株AC1892(GCF018139265)亲缘关系最近，二者遗传距离为206个SNP。
图2：中国医院不动杆菌的系统发育研究(最大似然法)
| 医院不动杆菌泛基因组中的毒力相关基因
研究者对157个医院不动杆菌基因组的578,446个蛋白质编码序列(CDS)进行了泛基因组分析。通过基因家族聚类获得了13,677个直系同源基因(OG)。其中，1862个为核心基因，其余的为辅助基因。在所有OG中，有3742个为菌株特异性基因，可能与菌株的独特表型相关。
在医院不动杆菌的泛基因组中检测到759个毒力相关基因(VAGs)。其中，约2/3(531个基因)为辅助基因，其余为核心基因。这些VAG编码的产物涉及与免疫调节、黏附、外毒素等14个主要功能类别相关的128个毒力因子。WHM01基因组中包括了426个VAG(228个核心基因、198个辅助基因)。FabZ、flmK等参与脂多糖脂质A生物合成的基因存在于所有医院不动杆菌菌株中。此外，还在医院不动杆菌的泛基因组中发现了58个(17个核心基因、41个辅助基因)参与T4P合成的基因。大量的辅助VAG可能有助于菌株表型和毒力多样性，图3展示了医院不动杆菌中编码细胞表面毒力因子辅助基因的遗传差异。
图3：医院不动杆菌LOS生物合成相关辅助基因的遗传分布及序列保守分析
· 文 / 章 / 总 / 结
本研究中，在1名伤口感染导致脓毒症患者的宏基因组数据中发现了一种高丰度的病原体--医院不动杆菌。通过比较和评估3种不同的组装策略，获得了基因组完整性为100%的医院不动杆菌ST410菌株(WHM01)基因组，并分析了其系统发育和流行病学特征。群体基因组分析揭示了医院不动杆菌中存在的毒力因子编码基因，为进一步研究该病原菌的病理生理学提供基础。本研究表明，宏基因组监测在微生物群落中优势菌株致病风险、以及破译毒力基因或其他类型基因遗传多样性方面具有广阔的应用前景。
本研究由北京医卫健康公益基金会项目资助（TYU-039F）
华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊重症医学科静亮博士为第一作者，华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊重症医学科祝伟教授、探因医学CEO方圆博士担任通讯作者。
