文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smtd.202000792

2020年12月13日，复旦大学附属中山医院感染病科胡必杰团队在Small Methods（IF=12.13）上发表题为High-Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings的综述，该文章是中国团队发表的第一篇mNGS临床应用的高分综述，中山医院感染病科李娜与探因医学蔡青青为本文共同第一作者，胡必杰教授为本文通讯作者。文章详细介绍了高通量测序技术在临床病原微生物检测中的应用，对临床应用的限制因素及解决方案进行了深入探讨。

病原微生物的测序诊断历程

测序技术在病原微生物检测的应用广泛，一代、二代及三代测序技术各有特色。一代测序因其通量低、检测靶标单一的劣势，已退居二三线，主要用于小基因组病原的全基因组测序以及验证二代测序检测到的微生物的真实性。现阶段，二代测序凭借其通量高、测序耗时适宜、精准度高、测序模式灵活、成本适宜等优势成为了病原微生物检测的主力军。三代测序在病原检测中的应用也逐步从科研领域向临床检测转化，其快速、长读长以及实时测序数据获取的特点决定了在病原微生物检测中将拥有得天独厚的优势。

图一：病原诊断中常用的测序平台及其性能指标

病原微生物测序流程

病原微生物高通量检测过程主要包括实验操作（湿实验）和生信分析（干实验）两个部分，湿实验环节主要有以下四个步骤：样本前处理，核酸抽提，文库构建和上机测序。生信分析环节则主要包括以下几个步骤：数据质控，人源序列去除，微生物物种比对鉴定，耐药基因与毒力基因分析等。

图二：病原微生物测序流程

湿实验板块

样本前处理：不同类型样本的前处理流程差异较大，痰液样本因其质地粘稠需要进行液化处理；新鲜组织样本需要进行匀浆消化操作，FFPE样本则需要经过脱蜡处理，前者人源背景高，后者存在核酸损伤与环境微生物污染的风险，并非病原微生物检测样本的最佳选择。

核酸抽提：针对不同类型样本也有不同的核酸抽提策略，外周血样本常采用cf DNA/cf RNA抽提策略。

文库构建：目前可用于开展宏基因组二代测序的测序仪较多，包括Illumina、BGI、Oxford Nanopore及PacBio公司的测序平台，不同仪器的文库构建方案也存在较大差异，其中二代测序文库构建的复杂度高于三代测序。

干实验板块

数据质控：低质量的序列会对下游分析过程造成干扰，增加假阳性的风险。Trimomatica或Fastp软件常用于去除接头序列、低质量序列、低复杂度序列以及短读长序列。

人源背景去除：人源背景去除是生信分析流程中重要的一步，在这个过程中也可以去除噬菌体、质粒以及工程菌等干扰序列。

微生物数据库构建：微生物类别异常丰富，针对病原微生物建立专有参考数据库是行业共识。数据库的构建需要考量不同微生物研究的不均衡性，基于形态学的分类与比较基因组学之间的差异，物种间的相似性大于某些菌株之间的相似性等因素。

微生物鉴定：主流的分析软件大多基于K-mer算法，unclassed reads较多的样本中可能存在未知种类的微生物，可以通过与nr库进行比对，提示相关物种。
报告原则：针对不同的类型样本以及不同类型的病原体需要建立不同的阈值机制，实验过程中设置NTC用以监测实验室环境、试剂中存在的背景菌，该项策略也能辅助矫正报告误差。

图三：生物信息分析流程

高通量测序技术在临床诊断的应用

高通量测序技术在不同系统感染中的应用

血流感染：外周血作为血流感染首选的检测样本，mNGS可显著提高血流感染的精准诊断效率，缩短了病原诊断时间，促进抗菌药物的合理应用。此外，mNGS的应用揭示了健康人外周血中也可能存在微生物核酸序列，颠覆了原有认知。

中枢神经系统感染：mNGS在中枢神经系统细菌性感染方面比传统检测方法具有更高的检出率，且受抗菌药物影响更小，但不能取代细菌培养等传统检测方法。此外，mNGS在诊断中枢神经系统结核、病毒、特殊病原体（如布鲁氏菌）、寄生虫等病原体感染方面也具有不可替代的优势，而在隐球菌和曲霉等真菌性病原体的检测需与传统检测方法结合。mNGS检测也有助于非感染性疾病如自身免疫性脑炎的鉴别诊断，帮助指导用药。总体来说，mNGS可作为慢性和复发性中枢神经系统感染的一线诊断方法，急性脑炎病例的二线诊断方法，推荐将mNGS与常规微生物检测手段结合使用。

呼吸道感染：mNGS可对呼吸道感染提供快速、精准的病原检测和鉴定，有效指导抗菌药物的合理应用，避免滥用。mNSG对苛养菌（如结核/非结核分枝杆菌、诺卡菌、放线菌、厌氧菌等）、病毒等的检测灵敏度优于或不劣于传统检测方法。总体来说，mNGS检测的灵敏度在不同的呼吸道样本中差异不显著，但是针对非结核分枝杆菌的检测，肺泡灌洗液的检测灵敏度要优于痰液样本。此外，mNGS在肺部混合性感染的诊断效率优于传统检测方法。

骨和关节感染：针对骨和关节感染的患者，滑膜液、植入物的超声清洗液以及假体周围的组织都可以用作mNGS检测的标本。尤其推荐微生物培养结果为阴性、经验性抗菌药物治疗效果不佳以及清创效果差的患者使用mNGS进行病原检测。

尿路感染：mNGS在细菌、真菌性尿路感染方面并不优于传统检测方法，对于病毒性（如肾移植后多瘤病毒）感染、复杂性尿路感染诊断方面具有优势。此外，尿液检测中的限制点在于报告解读难度大，远端尿道、尿道周围皮肤以及阴道定植菌会干扰报告判读，需要有经验的临床医生参与解读。

消化系统感染：mNGS在肠道病原鉴定中的应用较少，其更大的应用价值体现在肠道病原微生物中耐药基因鉴定，以及识别罕见病毒性肝炎的原因。

复杂和非典型病原体感染：许多病例已经证明了mNGS在鉴定复杂和非典型病原体感染方面的优越性。

高通量测序技术在特殊人群感染中的应用

免疫功能低下患者：推荐mNGS作为实体器官移植和造血干细胞移植患者的一线感染诊断、监测工具或作为常规检测的补充手段。

不明原因发热患者：mNGS已经极大提高了不明原因发热患者的病原诊断效率，并有望用作发热待查患者的一体化诊断测试，用于区分感染和非感染，以及发现新发病原体。

不明原因肺炎：新型冠状病毒最初由mNGS技术鉴定出，该技术对于监测和应对突发传染性疾病具有重要价值。

医院感染预防与控制

医院感染预防与控制管理是医疗管理的重要内容，医院感染发生在全世界范围内，影响数亿患者。mNGS不仅可用于临床样本还可用于环境样本的检测，辅助追溯病原传染源及传播途径。

NGS在病原体诊断中面临的挑战及可能的解决方案

人源宿主去除：去除宿主DNA和富集病原微生物的方法主要包括以下两类：(1)基于宿主细胞和微生物细胞大小的差异去除宿主细胞，如离心法和过滤法；(2)选择性裂解宿主细胞，然后用酶或化学试剂处理去除暴露的DNA。

胞内菌和真菌的破壁：目前用于细胞壁破壁的方法主要包括三类，第一类是物理破壁，第二类是机械破壁，第三类则是化学法破壁。

耐药基因和毒力基因检测：有效测序量（非人源）不足、二代测序读长短、耐药机制复杂多样以及基因型和表型可能不一致，阻碍了宏基因组二代测序在耐药基因和毒力基因检测中的应用。三代测序技术的长读长、高通量、实时测序的特点决定了其在耐药基因与毒力基因检测领域应用的广阔前景。

微生物数据库的优化：针对微生物数据库的选择需要考虑以下因素：1) 罕见病原体或新出现的病原体菌株的参考数据库不完整；2) 参考数据库具有物种偏好性；3) 某些重要的病原体的序列可能存在高度同源性（例如分枝杆菌的菌种）。

病毒鉴定

病毒参考基因组纳入标准，除了需要对公共数据库中的基因组进行分类确认、污染过滤、基因组质量评级之外，还需要根据病毒基因组的特性，优化比对算法，进行平行分析或者验证性鉴定确认。

报告解读

mNGS报告解读较为繁琐，暂未形成行业标准，需要临床医师、测序技术团队成员以及有病原微生物研究背景的成员通力合作，在考量样本采集准确性，检测质量控制，微生物特性、检出情况以及患者临床情况的条件下，给予合理的解读。

与传统检测方法相比存在的局限性

在某些临床应用场景中，mNGS可以作为传统检测方法的有力补充，避免“一刀切”的模式。

临床应用监管

mNGS的临床应用尚处于早期阶段，还未形成FDA或NMPA批准的用于病原诊断的流程与方法，临床应用共识和指南也有待完善。希望在未来几年有更多高质量的mNGS临床研究，为该项技术在临床的应用提供指导。

图四：国内外专家共识与指南

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