人工关节感染（PJI）难根治，且发病率、死亡率高，早期精准诊断是有效治疗的关键。目前，常规微生物培养法以及生化试验存在假阴性率高、耗时长等缺陷。基于PCR的病原分子检测技术已取得部分进展，但该技术十分容易受到污染物的影响，从而产生假阳性结果。宏基因组下一代测序技术（mNGS）可不依赖于培养、快速、无偏向性地从样本中获得全部病原的基因组信息，逐渐成为提高PJI诊断水平的有力工具。
本综述讨论了分子技术在PJI诊断中的优势和不足，分析总结了mNGS在PJI诊断中的应用现状及未来发展方向。认为mNGS可作为培养技术的重要辅助手段，加强对培养不能覆盖的病原的检测。mNGS技术的优化和完善有助于更好地鉴定病毒、真菌、耐药基因以及抗生素治疗后患者的感染。
① 人工关节感染可能会引起并发症，进一步提高发病率和死亡率，需及时诊疗；② 目前，PJI缺乏诊断标准，依赖于多种方法的组合，诊断困难；③ 培养是临床常用的PJI诊断方法，但耗时长且易受生物被膜以及抗生素的影响，假阴性率高；④ 不依赖于培养的分子技术（如PCR和mNGS）在PJI的诊断中发挥了越来越重大的作用；⑤ 作为一种强有力的分子工具，mNGS通过直接检测患者样本中所有DNA/RNA以快速识别未知病原，准确性、敏感性、特异性高，是PJI诊断的重要辅助手段。
PJI可由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌等多种类型病原体引起，从感染性质上可分为单一病原感染和混合感染，表1展示了人工髋、膝关节感染的常见病原。最近，多重耐药菌（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多重耐药绿脓杆菌）引起的PJI发病率不断攀升，并受到广泛关注。
此外，微生物可附着在植入体表面并形成生物被膜，可促进病原的持续感染，保护病原免受宿主免疫反应并产生抗生素抗性，是PJI发病过程中的重要环节。
表1：人工髋关节和膝关节感染的常见病原菌
由于症状的非特异性、培养结果的高假阴性率，PJI的临床诊断极具挑战。目前，PJI的诊断依赖于微生物学、组织病理学、生化试验、分子技术以及临床检查等多种方法的组合。
· 基于PCR的分子检测技术
PCR和NGS等分子技术不依赖于培养，可在一定程度上克服培养阴性率高等缺点。其中，PCR技术包括特异性PCR和宽范围PCR（BR-PCR）。特异性PCR可针对任何单种病原生物进行，且高度灵敏，但需要先明确物种后设计特异性引物进行检测。相比之下，基于16S rDNA的BR-PCR结合NGS可一次性鉴定更多不同的细菌物种，在PJI的诊断中展示出更大的应用价值（图1）。尽管如此，该技术仍存在不能同时检出真菌或病毒等其他类型病原、无法进一步分析抗生素抗性基因、易受污染影响而产生假阳性等不足。
图1：基于BR-PCR检测PJI患者细菌16S rDNA的工作流程
· mNGS
mNGS技术不依赖于培养、无需特异性扩增，通过直接对样本中所有DNA或RNA进行测序，然后与数据库进行比对以识别样本中全部类型微生物（图2）。通过mNGS数据还支持进一步的分析抗生素耐药性和宿主免疫反应特征。因此mNGS在传染病诊断中的应用潜力巨大。研究表明， mNGS可应用于PJI患者滑膜液、假体周围组织、假体超声液等样本的病原检测，且检出病原体种类与培养结果高度一致。mNGS与培养法的特异性相当，但mNGS敏感性更高，并且可帮助诊断常规方法无法确定的感染，尤其是受抗生素使用、生物被膜以及苛养菌等因素导致的培养阴性病例。
图2：利用mNGS鉴定PJI病原的工作流程
· 根据mNGS结果优化培养方法，可提高关节感染的诊断水平
在一项研究中，用常规条件和根据mNGS结果优化后的条件对术中采集的滑膜液、超声液和假体周围组织进行培养，并对二者产生的结果进行比较分析。结果表明，与常规培养（60%、80.95%和67.86%）相比，优化条件后培养的敏感性、特异性和准确性（94.29%、76.19%和87.5%）显著提高。作者总结到，mNGS可作为改进传统培养的方法，加强病原检测覆盖度，成为诊断PJI的有效工具。
· mNGS的利弊
优势：① 耗时短，敏感性、特异性、准确性高；② 不需对病原做出预判、不需提前扩增目的基因；③ 覆盖范围广，可一次性检出所有类型病原，能识别未知病原；④ 可获得病原完整基因图谱，对种水平的鉴定更准确；⑤ 在检测抗生素抗药性基因方面的前景广阔。
劣势：① 价格昂贵；② 样品制备和数据分析复杂；③ 易受污染影响产生假阳性结果。
· 污染
样品采集、处理、实验过程中均有可能引入污染，导致假阳性，从而影响mNGS结果的解读。可通过阴性对照区分背景污染，也可通过试剂评估和定期的Swipe试验以减少交叉污染。
· 死亡病原
mNGS不同于培养，可检测到样品中存在的任何核酸信息，样品中任何死亡病原残留物都可能导致假阳性、多病原或与PJI无关的结果。（编者：RNA的表达常与病原体转录活性有关，反应其活跃程度，因此，同时检测RNA可帮助确认病原活性）
· 病毒与真菌的鉴定
基于16S rDNA的PCR技术仅能识别细菌，并不能识别PJI中的真菌和病毒，mNGS可在一定程度上弥补这一不足。对于真菌等（细胞壁结构复杂）微生物来说，常规样本制备方法导致mNGS的检测能力降低。（编者：通过优化样本制备方法结合mNGS，可实现一次性全面检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等不同类型的病原）
· 生信分析
需要可靠的生物信息学工具和数据库来确定检测到的微生物是不是真正的责任病原。BLAST、BWA等序列处理工具耗时长，不利于临床感染样本mNGS检测数据的处理。Cosmos ID 分析平台 (https://www.cosmosid.com/platform) 通过改进算法降低了分析结果的假阳性率，并能提供抗性基因的耐药性相关参考数据。（除降低污染造成的假阳性外，还需要进一步的构建不同类型样本或不同类型患者的背景数据库以区分定植菌）
mNGS技术的检测速度远远快于培养，可以减少培养阴性感染的不确定性，可作为诊断PJI的潜在工具。mNGS技术有助于更早的启动治疗方案，有助于精准抗感染，可能降低发病率和死亡率。然而在进一步应用于临床实践之前，需解决诸如样本制备、数据分析难的问题。
